隔离病房隔离效果的微生物学实验方法

摘要：净化隔离效果研究中多数采用发尘的方法，发尘的方法受多种条件的限制。本文介绍隔离病房的研究中采用发菌的实验方法，同时采用特别的菌种，克服了室内产尘和室内中已有细菌对实验结果的影响。本论文是“隔离病房隔离效果的研究”课题的分课题之一。   

关键词：发菌实验 采样器 培养皿

    Microbiology experimental method of insulating effect on insulating ward

    Abstract Insulating effect research usually adopt method of emit dust, but method of emit dust was restricted. The article content is method of emit especially bacteria in insulating effect research. The method merit avoid effect of the dust and bacteria in the room.

    Keywords bacteria experiment, sampling instrument, culture container

    微生物气溶胶对人类的生命健康有极大的影响，全球约有500多种致病菌，经气溶胶传播的就有100多种，占首位。战争狂人及恐怖主义者都以气溶胶的形式释放生物战剂。包括食道传播的霍乱弧菌、经皮肤及接触传播的出血热等。我国院内感染也以呼吸道感染为主。特别是SARS病毒，是最典型的气溶胶传播。研究微生物气溶胶在隔离病房的扩散规律，将为大量建造高效隔离病房及正确使用提供科学依据。

    1、实验目的：隔离病房将通过定向气流、负压差和缓冲室，阻隔室内含致病微生物的气溶胶，向室外的传播。为了验证这些措施的隔离效果，通常可采用大气尘气溶胶和微生物气溶胶进行实验。但前者的不稳定性、不易网格多点采样的特点，使在研究气溶胶浓度场方面有不足之处。而一些措施的优劣与其对浓度场的影响很有关，因此，上述后者即微生物气溶胶用于实验研究，就可克服所述缺点，同时要隔离的正是微生物气溶胶，因此，直接给出微生物浓度场的数据，将更有直观说服力。这就是采用微生物学方法研究隔离病房隔离效果的目的。

    2、实验方案：

    1、   回风口发菌，送风口采样，测定高效过滤器过滤效果。

    2、模拟病人发菌，隔离病房中在不同因素（如换气次数、风口位置等）影响下的污染范围的测定。

    3、模拟病人发菌，通过缓冲间进出入隔离病房研究，不同温差、压差情况下缓冲间的隔离效果。

    3、实验材料

    3.1菌种的选择

    实验菌种的选择对实验结果的可信性起着关键作用，因为空气中有大量的细菌，如果采用空气中已有的细菌，必然在实验前进行长时间的自净，并进行实验前实验室的本底实验，在实验结果中减去本底菌量，即便如此仍不能彻底消除实验方法本身的误差。实验采用的菌种不能对实验人员有伤害，这是实验的最基本的要求。

本次实验采用菌种：枯草杆菌黑色芽孢变种，菌号ATCC:15442;1.3343.中国科学院菌种保藏中心提供。采用此种菌种的原因是此种菌种培养出来后是有颜色的，呈淡黄色（见图1，白色菌为空气中的杂菌），和空气中的杂菌有明显的颜色差别，这样就克服了空气中其它杂菌对实验结果计数的影响。采用此种菌种，实验前不需要自净。
    

    图1枯草杆菌黑色芽孢变种图

    3.2菌浓的选择

    发菌浓度的影响，在发菌实验中发菌浓度对实验数据的采集有重大的影响，发菌浓度过高，会造成采样器中菌量过大，从而无法计数（见图2），发菌浓度过小，采样器不能采集到，不能说明什么问题，采用多少发菌浓度需预先估计，通过反复实验再找到最佳的浓度。通过实验，在发菌空气流量7L/min左右的条件下，在全室发菌测室内菌分布情况时，菌浓为106~108cfu/ml较合适的，测过滤器的排风效率时，菌浓为109~1011cfu/ml较合适的，测量缓冲室隔离效果时菌浓为1011~1013cfu/ml较合适的。
   

    图2发菌量大的培养皿图

    4、发菌系统

    发菌系统如图3所示，打气机（如图4）供气的压力稳定，通过调节打气机后的调节阀门来调节供气量，在发菌前先通过流量计来调节气体的流量到发生器所需的流量。发生器宜略向上倾斜，这样可以使发菌时所带出的较大的液珠撞击喷口时，凝结产生的液滴可以流回发生器内。同时注意观察发生器内的液量，始终保持发生器金属柱的小孔一直处于液面之下，以保持发菌的连续性。
   

    图3微生物气溶胶发生系统                     

    1 喷雾器 2菌液 3 过滤器 4 流量计 5 压力表 6 缓冲箱 7 打气机 8 过滤器
     

    图4 打气机

    发生器采用302医院研发的专用发生器（如图5）。该发生器发生的粒径均匀，易于在室内扩散。
   

    图5 发生器图                 

    在做排风效率的实验中，为防止菌雾未通过过滤器而直接通过边框泄漏，实验时，在回风口做了套管（如图6），套管的尺寸小于过滤器的尺寸，同时套管有一定的长度，在套管内发菌，使菌雾与排风充分混合。
   

    图6排风套管图

    5、沉降菌的采样

    5.1模拟病人口部发菌的装置如图7所示
   

    图7 发生器模拟病人口部图

    5.2采样在研究不同送、排风方式情况下室内的污染情况，采用培养皿来测量沉降菌，利用培养皿有灵活布置的特点。培养皿的布置应尽量多，同时在医护人员的工作区应密布，工作区沉降菌的多少也是送风方式优劣的主要评价指标。培养皿的布置方法参见图8。培养皿布置高度：床位置布置在床上，其他布置在地面上（如图9、图10）。
   

    图8室内地面采样点布局
   

    图9床位置培养皿布置图
    
    图10房间培养皿布置图

    在研究不同温差、压差条件下，缓冲室的作用时，布置培养皿的方式参见图11，开关门时的动作要与医护人员进出的时间基本一致，不超过2秒，尽量模拟实际情况。也可增加缓冲室的停留时间，来研究缓冲间的自净影响。
        

    图11 :缓冲隔离效果采样点布局

    6浮游菌的采样

    浮游菌的采集采用Andersen采样器。

    6.1Andersen采样器的流量要求

    采集采用Andersen采样器流量为1ft3/min（2.83L/min）。这种流量用一般抽气泵均可达到。用一个0~35 L/min的转子流量计即可进行校对。流量准确无误是使用该采样器的关键操作步骤。流量影响流速，流速又影响撞击效率。因此流量不准确或未经校对的采样器不可使用。

    6.2Andersen采样器的真空度要求

    使用Andersen采样器在使用时，另一个关键是各节之间的密封度，如果密封度不够，也就是说它的真空度不够，从表面上看，它的流量仍然合乎要求，但这实际是一种假象。因真空度不够，亦可影响气流速度，进而影响采样效率。因此流量和真空度是该采样器操作时的关键。在采样器出口处用一个大螺旋来调节真空度达到0.04英寸汞柱高即可。

    6.3Andersen采样器的消毒

    该型采样器在采样前，除要求平皿及培养基消毒处外，采样器本身也要进行消毒处理，其方法有3种，75%的乙醇消毒、高压蒸汽消毒、环氧乙烷消毒。在消毒方面应该注意，虽然该型采样器的铝制部分，都进行了阳极化处理，有抗腐蚀的功能。但亦不能用有腐蚀性的消毒液消毒，因为长期使用仍可能腐蚀。

    6.4Andersen采样器的采样方法

    采样用的带培养基平皿要预先倒好，并进行预培养，当确认无菌时，方可使用。另外在倒平皿时，要确保水平，否则不能保证400个喷口的撞击距离保持一样。甚至有的因培养皿太厚将喷口孔堵塞。

采样时，要求采样器放到一定高度，采样人员要原离采样头，以避免将操作者自身散发到环境中去的微生物气溶胶粒子采到。

    采样时还要对现场的空气微生物浓度进行大体估计，以便设计采样的时间。因为如果环境的微生物浓度太高，采样的时间又长，则使许多微生物在撞击点处重叠，产生较大误差。如果环境微生物浓度过低，采样时间又太短以至于采到的微生物粒子太低或没有就不能准确评价。

    操作时先将平皿连盖放到采样器里，并保持水平，然后迅速打开盖，立即放上采样器的顶盖。这样可保证将实际误差降到最低点。

    7、细菌的培养与计数

    将采样好的平皿立即盖上盖，细菌类在36~37℃培养2天，

    培养皿的计数方法很多，常规方法如下：

    分段计数法

    当采到的菌落很多，在他们长大汇合之前，用剖视镜及早观察，将平皿划出许多相等的部分抽出一部分数菌，然后乘以划分份数，即可得出每皿总菌数。如菌数不多，可直接数菌落数。

    菌落计数器

    目前已研制出一种利用透光率不同的菌落计数器，该仪器计数速度快，只要将平皿放上，即可读出数，误差不大于%。

    求出平皿上的总菌数后，按下式计算浓度：

    8、实验方法

    表1：实验项目及方法

    9、实验室消毒方法

    按体积取福尔马林25-50ml，再按1：1的比例加水，用加热法蒸发（一定要在室外控制电源）。关好门，并用纸条（胶布）将门缝封严。封闭24小时后，用25%的氨水来中和甲醛，中和量为福尔马林的一半。人在整个操作中不能直接进入消毒间，消毒后进入时应注意防护。因甲醛气体有可燃性，熏蒸时不能开风机，防明火。

    结论：
    1、隔离效果的实验采用气溶胶的发菌实验可克服大气发尘实验中尘源的干扰。

    2、枯草杆菌黑色芽孢变种菌种有颜色的特点避免了空气中杂菌对实验的影响。

    3、气溶胶发菌实验更接近于实际情况，增加了实验的可靠性。

    4、在发菌空气流量7L/min左右的条件下，在全室发菌测室内菌分布情况时，菌浓为106~108cfu/ml较合适，测排风过滤器的效率时，菌浓为109~1011cfu/ml较合适，测量缓冲室隔离效果时菌浓为1011~1013cfu/ml较合适。